腸道EB病毒感染組織檢測
中國人群EB病毒(Epstein-Barr virus)血清學(xué)陽(yáng)性率高達95%以上，絕大部分屬于潛伏感染。當全身或局部免疫力低下時(shí)，可引起EB病毒的再激活，導致EB病毒機會(huì )性感染。IBD患者腸道局部炎癥刺激和免疫抑制劑的使用，易導致EB病毒重激活并加重病情。腸道EB病毒感染的診斷及其對IBD病情發(fā)展的影響日益受到關(guān)注。結腸黏膜活組織檢查(以下簡(jiǎn)稱(chēng)活檢)標本中EB病毒感染檢測是確定腸道EB病毒感染的主要方法。為統一腸道EB病毒感染的組織標本檢測及判讀方法，并進(jìn)一步規范腸道EB病毒感染的臨床病理診斷，中華醫學(xué)會(huì )消化病學(xué)分會(huì )消化病理協(xié)作組組織專(zhuān)家進(jìn)行了腸道病理組織EB病毒感染檢測質(zhì)量控制和EB病毒感染意義共識討論會(huì )，對EB病毒感染的檢測方法、判讀、計數和臨床病理意義等開(kāi)展廣泛討論并達成共識。
一、腸道黏膜活檢取材
腸道EB病毒感染時(shí)，病毒在黏膜組織中分布不均，潰瘍處病毒負荷顯著(zhù)高于非潰瘍黏膜，為確定有無(wú)EB病毒感染，內鏡活檢取材部位應重點(diǎn)位于潰瘍處。但是初診患者或診斷不明的患者，為明確診斷，內鏡活檢應為系統性活檢，上消化道活檢部位應包括食管、胃體、胃竇和十二指腸，下消化道活檢部位應包括回腸末端、盲腸、升結腸、橫結腸、降結腸、乙狀結腸和直腸，取材應取潰瘍旁黏膜組織，避免只在潰瘍底部取材。
二、EB病毒感染檢測方法
EB病毒感染檢測方法包括原位雜交、PCR和免疫組織化學(xué)技術(shù)。原位雜交檢測EB病毒編碼的小RNA(Epstein-Barr virus-encoded RNA, EBER)在EB病毒潛伏期和病毒復制期均大量存在于感染細胞的細胞核內，EBER原位雜交可在組織切片確定EB病毒感染細胞及其在組織中的定位。PCR可定量檢測EB病毒DNA，但無(wú)法確定感染細胞及其在組織中的定位，常用于檢測外周血EB病毒負荷。免疫組織化學(xué)法可檢測EB病毒表達蛋白質(zhì)，包括EB病毒核抗原和潛伏膜蛋白，這些蛋白質(zhì)分別在病毒感染的不同時(shí)期表達。免疫組織化學(xué)法僅能檢測病毒蛋白質(zhì)表達階段，對于細胞內EB病毒低拷貝的檢測靈敏性差。上述方法中EBER原位雜交具有高度靈敏性和特異性，組織定位明確，是檢測EB病毒感染的金標準。本共識推薦腸道EB病毒感染檢測統一采用EBER原位雜交。
三、EBER原位雜交及顯色方法
目前常用的EBER原位雜交試劑分別有適用于手工和全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀兩種類(lèi)型的試劑盒，在規范操作規程下，手工操作和全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀操作可達到類(lèi)似的染色效果。
常用的顯色方法包括DAB顯色和氯化硝基四氮唑/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸二鈉鹽(nitro-blue-tetrazolium chloride/5-bromo-4-chloro-3-indonyl phosphate，NBT-BCIP)顯色。DAB顯色陽(yáng)性信號著(zhù)色為棕褐色，蘇木精復染細胞核呈藍色。NBT-BCIP顯色陽(yáng)性信號著(zhù)色為深藍色，核固紅復染細胞核呈淡紅色。DAB和NBT-BCIP兩種顯色方法相比較，DAB顯色方法更清晰、穩定，蘇木精襯染對細胞結構的顯示清晰，DAB-蘇木精組合更符合病理醫師閱片習慣。NBT-BCIP在組織中陽(yáng)性信號不易受背景干擾，識別特異性高，但陽(yáng)性信號不穩定，易被洗脫導致信號丟失。DAB和NBT-BCIP兩種顯色方法各有優(yōu)勢，只要陽(yáng)性信號定位清晰、明確，背景非特異著(zhù)色無(wú)或很輕，對判斷陽(yáng)性信號無(wú)影響，均可采用。
四、組織處理及設立對照
送檢組織標本應用10%中性甲醛溶液及時(shí)固定，最佳固定時(shí)間為8～12 h。采用新鮮蠟塊，盡量不使用2年以上的蠟塊。待測組織切片后應盡快進(jìn)行原位雜交檢測，室溫中放置的切片需在1周內完成檢測。
每例原位雜交檢測都應設置陽(yáng)性對照、標本質(zhì)量對照和空白對照。陽(yáng)性對照：以鼻咽癌組織切片進(jìn)行原位雜交檢測。標本質(zhì)量對照：一般采用針對U6細胞核小RNA的Oligo探針，對待檢組織切片進(jìn)行原位雜交檢測，出現所有細胞核陽(yáng)性，則證明待測組織標本RNA保存良好，適合進(jìn)行原位雜交檢測。空白對照：以PBS代替探針，對待檢組織切片進(jìn)行原位雜交檢測。在各種因素影響下無(wú)法常規實(shí)現以上3種對照時(shí)，本共識建議至少設立陽(yáng)性對照與空白對照。
五、EBER原位雜交的判讀
判讀時(shí)首先應確定陽(yáng)性對照是否定位正確，清晰易辨，Oligo探針對照(即標本質(zhì)量對照)彌漫陽(yáng)性，空白對照無(wú)細胞著(zhù)色。對照組織切片染色結果理想，才可對待檢組織切片進(jìn)行判讀。當對照組織切片染色不理想時(shí)，待檢組織切片的結果不可靠，應仔細查找原因，并重新檢測。
六、計數方法
①選擇陽(yáng)性細胞最密集處，計數1個(gè)高倍視野(400倍)下陽(yáng)性細胞數作為EBER陽(yáng)性細胞計數。②在陽(yáng)性細胞密集處，數10個(gè)高倍視野(400倍)下陽(yáng)性細胞數，取其平均值作為EBER陽(yáng)性細胞計數。方法①計數方便快捷，方法②計數能較客觀(guān)地反映組織中EBER陽(yáng)性細胞數，但是實(shí)際操作比較繁瑣耗時(shí)，適用于科學(xué)研究。在陽(yáng)性細胞分布不均的病例中，兩種方法計數結果可能有較大差別。各單位采用統一的計數方法，其結果才具有可比性。本共識建議在實(shí)際工作中，統一采用方法①進(jìn)行計數，并在病理報告中說(shuō)明采用的計數方法。
七、黏膜活檢組織中EBER陽(yáng)性的臨床意義
結腸黏膜EBER陽(yáng)性細胞一般為淋巴細胞。結腸黏膜活檢組織中EBER陽(yáng)性可見(jiàn)于炎癥性病變和腫瘤性病變，極少見(jiàn)于正常結腸黏膜組織。EBER陽(yáng)性的炎癥性病變多見(jiàn)于IBD患者合并EB病毒感染，腫瘤性病變則為EB病毒相關(guān)淋巴組織增殖性病變/淋巴瘤。
1．EBER陽(yáng)性腸道炎癥性病變：
該病變多見(jiàn)于IBD，尤其是UC，由于腸道局部炎癥刺激和免疫抑制劑的應用，引起潛伏EB病毒的再激活。EBER陽(yáng)性的意義不能孤立地以EBER陽(yáng)性細胞數進(jìn)行界定，需要綜合臨床表現、內鏡特征、組織學(xué)特征，并參考外周血EB病毒DNA拷貝數進(jìn)行綜合分析。本共識建議將EBER的陽(yáng)性表達分為高表達、低表達和無(wú)臨床意義的非致病性潛伏感染3種類(lèi)型。①EBER高表達：對于組織中有臨床意義的EBER陽(yáng)性細胞數，目前尚鮮見(jiàn)文獻提出明確的陽(yáng)性界值，本共識建議暫定每高倍視野EBER陽(yáng)性細胞數≥10作為EBER高表達的標準，需考慮EB病毒性腸炎。由于單純EB病毒性腸炎少見(jiàn)，該類(lèi)情況多見(jiàn)于IBD合并EB病毒性腸炎(機會(huì )性感染)，其中UC合并EB病毒性腸炎多于CD合并EB病毒性腸炎。由于免疫抑制劑和生物制劑的使用，使局部免疫監視下降，潛伏的EB病毒再激活，導致比IBD基礎改變更嚴重的黏膜損傷，包括內鏡下表現的潰瘍與活動(dòng)性指標升高，臨床表現為難治性IBD，多伴外周血EB病毒DNA拷貝數不同程度升高。組織學(xué)上常表現為潰瘍，多量淋巴細胞、漿細胞浸潤，細胞一般無(wú)異型性(圖4)。②EBER低表達：每高倍視野EBER陽(yáng)性細胞數<10，臨床意義難以單獨依靠EBER陽(yáng)性細胞數確定，需要結合臨床綜合分析。若表現為IBD不能解釋的活動(dòng)性病變，或難治性IBD，則傾向IBD合并EB病毒性腸炎。若臨床和內鏡下均為無(wú)明顯異常表現，則傾向非致病性潛伏感染。③EBER非致病性潛伏感染：EBER陽(yáng)性細胞數為1～2個(gè)/高倍視野，全片僅個(gè)別陽(yáng)性細胞，多屬于無(wú)臨床意義的EB病毒非致病性潛伏感染。在炎癥等因素刺激下，局部出現EB病毒非特征性擴增，外周血EB病毒DNA拷貝數無(wú)增高。組織學(xué)表現為黏膜固有層淋巴細胞、漿細胞數量正常或僅有輕度增多，細胞無(wú)異型性
